15--deoxy--△12,14--prostaglandin J2对单核/巨噬细胞株生物学活性的作用机制研究

背景和目的:单核/巨噬细胞与先天和获得性免疫系统密切相关,在炎症反应发生时,它们的活化会导致组织损伤.15-deoxy-△12,14-prostaglandinJ2(15d-PGJ2)是近年来发现的在组织损伤、炎症反应和氧化应激中释放的一种内源性物质,有研究证实,15d-PGJ2是过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma,PPARγ)的内源性配体.尽管许多报道证实15d-PGJ2在体内发挥着重要的生物学功能,但是它对于单核/巨噬细胞生物学特性的调节机制仍有待研究.本研究通过体外建立脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠单核/巨噬细胞株(RAW264.7和J774A.1)的炎症模型,探讨15d-PGJ2对单核/巨噬细胞的吞噬,增殖和炎性因子表达能力的影响及可能的调控机制.
方法:
1.15d-PGJ2对单核/巨噬细胞吞噬的检测
将细胞分别暴露于15d-PGJ2、PPARγ的人工合成配体曲格列酮或环格列酮中,用光学显微镜观察细胞吞噬乳胶珠的数目,来评价15d-PGJ2对RAW264.7和J774A.1吞噬能力的改变是否与PPARγ的激活相关;将细胞预孵育于N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC,抗氧化剂)中,再暴露于15d-PGJ2,通过观察细胞吞噬乳胶珠的数目来评价15d-PGJ2对RAW264.7和J774A.1吞噬能力的改变是否与活化氧残基(reactiveoxygenspecies,ROS)的产生相关.
2.15d-PGJ2对单核/巨噬细胞增殖的检测
采用细胞计数试剂盒8(CellCountingKit8,CCK8),检测15d-PGJ2对单核/巨噬细胞增殖的影响.将细胞分别暴露于15d-PGJ2、曲格列酮或环格列酮中,用CCK8法检测RAW264.7和J774A.1的增殖能力是否与PPARγ的激活相关;将细胞预孵育于NAC中,再暴露于15d-PGJ2,用CCK8法检测RAW264.7和J774A.1的增殖能力的改变是否与ROS的产生相关.
3.15d-PGJ2对单核/巨噬细胞炎症因子表达的检测
用Real-timeRT-PCR方法检测炎症因子:肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-α,TNFα)、转化生长因子(transforminggrowthfactor-β1,TGFβ1)、白介素6(interleukin-6,IL-6)、单核细胞趋化因子(monocytechemotacticprotein-1,MCP-1)mRNA的表达量.
4.15d-PGJ2对单核/巨噬细胞PPARγ的分布及表达的检测
用免疫细胞化学和高内涵技术(Cellomics)检测PPARγ在细胞中的分布状况,并用Scan软件统计分析PPARγ,抗体在细胞内的荧光强度;用Real-timeRT-PCR方法检测PPARγmRNA的表达量;用Westernblot方法检测PPARγ蛋白的表达量.
5.15d-PGJ2对单核/巨噬细胞内ROS产生的影响
用FloroskanAscent荧光分析仪观察RAW264.7和J774A.1在接受15d-PGJ2刺激后产生内源性ROS的水平是否发生变化.
结果:
1.15d-PGJ2剂量依赖性地抑制LPS诱导的RAW264.7和J774A.1的吞噬.PPARγ受体的拮抗剂GW9662不能阻断15d-PGJ2对RAW264.7和J774A.1吞噬功能的抑制作用;PPARγ受体的两种激动剂罗格列酮和环格列酮均不能有效的抑制RAW264.7和J774A.1的吞噬;而抗氧化剂NAC可阻断15d-PGJ2对RAW264.7和J774A.1吞噬功能的抑制作用.
2.15d-PGJ2剂量依赖性地抑制RAW264.7和J774A.1的增殖;PPARγ受体的拮抗剂GW9662不能阻断15d-PGJ2对RAW264.7和J774A.1增殖的抑制作用;PPARγ受体的激动剂罗格列酮和环格列酮均不能有效的抑制RAW264.7和J774A.1的增殖;而抗氧化剂NAC可阻断15d-PGJ2对RAW264.7和J774A.1增殖的抑制作用.
3.15d-PGJ2抑制LPS诱导的RAW264.7和J774A.1炎症因子mRNA的表达;抗氧化剂NAC可阻断15d-PGJ2对RAW264.7和J774A.1炎症因子mRNA表达的抑制作用;而PPARγ的激动剂罗格列酮和环格列酮均不能使炎症因mRNA的表达水平发生改变;
4.15d-PGJ2刺激RAW264.7和J774A.1后,PPARγ蛋白在细胞内的分布没有明显改变;细胞内PPARγ的mRNA和蛋白水平也未见明显改变;
5.15d-PGJ2刺激RAW264.7和J774A.1后,细胞内内源性ROS的水平显著上升.
结论:15d-PGJ2抑制单核/巨噬细胞株RAW264.7和J774A.1的增殖、吞噬活性,并且能有效的抑制细胞炎症因子的表达水平,其作用机制可能不依赖于PPARγ,受体的激活途径,而是依赖于细胞内的氧化应激反应.